总黄酮的分离纯化技术大孔树脂法纯化松花粉总黄酮的工艺研究
关键词:松花粉；黄酮类化合物；大孔吸附树脂；净化
松花粉是马尾松的干燥花粉。油松。或者属于同一科的几种植物。具有收敛止血、燥湿敛疮的功效，可用于外伤出血、湿疹、脓疱疮、皮肤糜烂、脓水淋漓。松花粉含有黄酮类、多糖、胆碱、脂肪酸、蛋白质、微量元素等成分。国内外临床证明，松花粉具有抗疲劳、降血糖、抗衰老、抑制前列腺增生、保护肝脏、调节免疫功能、减肥美容等多种药理作用，被誉为“花粉之王”。本文对松花粉中黄酮类化合物的纯化技术进行了深入系统的研究，以期为松花粉的进一步开发利用提供参考。
1实验材料
1.1仪器
FA1004N分析天平(上海第二分析仪器厂)；UV765紫外-可见分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)；RE-52旋转蒸发器(上海安亭实验仪器有限公司)；色谱柱2cm×50cm(金州优胜华博经销处)；D101大孔树脂(农药厂生产)；AB- 8和X-5(天津南开大学化工厂生产)
1.2药检
松花粉(购自陕西药材市场，经生药学教研室雷国连教授鉴定为松科植物马尾松的花粉)；芦丁对照品(购自中国药品生物制品检定所，批号:100080-200707)；其他试剂如乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝和氢氧化钠为分析纯，蒸馏水用于实验。
2总黄酮的测定方法
2.1总黄酮含量测定:NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法。芦丁标准溶液的浓度Y(mg/mL)与吸光度x的关系为:Y = 4.1164 x-0.0368(R2 = 0.0998)。
2.2黄酮类样品溶液的制备:取700g松花粉，加65438±00倍的60%乙醇提取两次，每次65438±0.5h，提取液过滤，减压回收乙醇，浓缩至无醇味，用水稀释至5000 ml作为供试品溶液。(总黄酮含量为0.497毫克/毫升)
3提纯工艺的研究
3.1大孔树脂的预处理
清洗色谱柱，防止其他物质污染树脂，排干柱内水，向色谱柱中加入95%乙醇，将新树脂放入柱内，浸泡24小时，用95%乙醇以2BV/h的流速通过树脂层，直至1ml和4ml蒸馏水的流出液不呈白色浑浊，再用相同流速的蒸馏水冲洗至无酒精味；用2BV5%HCl以6BV/h的流速通过树脂层并浸泡4h，然后用相同流速的蒸馏水使流出液PH中性，用2BV2%NaOH以6BV/h的流速通过树脂层并浸泡4h，再用相同流速的蒸馏水使流出液PH中性。
3.2树脂筛选
3.2.1不同大孔树脂对松花粉总黄酮的静态吸附
准确称取处理后的三种树脂各65438±0g，置于带塞带磨口的50mL三角瓶中，加入精密量取的试液20mL，在振荡器上振荡65438±02h，使其充分吸收，取上层液体65438±0ml，测定总黄酮含量。结果见表1。
3.3不同吸附树脂对松花粉总黄酮的静态洗脱性能考察实验树脂静态洗脱
用上一步总黄酮饱和的树脂，滤除表面水分，准确加入80%乙醇，在振荡器上振荡12h，测定总黄酮含量。结果如表2所示。
从表1和表2可以看出，D-101无论是饱和吸附量还是洗脱率都表现最好，因此选择D-101大孔吸附树脂纯化松花粉总黄酮。
3.5 D101大孔树脂纯化工艺。
3.5.1样品流速
将3g经处理的D101树脂通过湿法填充到柱中，将20 ml四种测试溶液(总黄酮浓度为0.497 mg mL-1)分别与0.5 mL min-1、1.0 mL min-65438混合。
从表3可以看出，样品的流速控制在1.0 ~ 1.5ml min-1较好。
样品浓度
向树脂柱中加入20ml 3种试液，控制流速为1 ml min-1，收集流出液，测量500nm处的吸光度，计算吸附率。结果见表4。
从表4可以看出，三种样品的树脂吸附率与浓度有关，浓度越高，吸附率越高。
pH值
取供试品溶液20mL，用1mol·L-1 HCl调节pH值为3、4、5、6、7，控制流速在1ml·min-1吸附，在1ml·min-65438使用50%乙醇。
从表5可以看出，将样品溶液的PH值调整到5.0-6.0比较好。
样品装载
将供试品溶液加入树脂柱，控制流速1ml min-1进行吸附，在500nm处测定并计算总黄酮含量，绘制D101大孔树脂的渗漏曲线。见图1。
从图1可以看出，当上样流出液体积为6BV时，大孔树脂接近饱和。此时树脂与原料的比例约为1:3。
洗脱液浓度
分别取供试品溶液20mL(总黄酮浓度为0.497mg·mL-1)，以1mL·min-1的流速动态吸附后，以6BV的水以1mL·min-1的流速洗脱。然后以1ml·min-1的流速梯度依次用10%、30%、50%、70%、90%乙醇5BV洗脱，收集洗脱液，测定洗脱液中黄酮类化合物的含量，计算黄酮类化合物的解吸率。结果如表6所示。
从表6可以看出，50%的乙醇解吸效果最好。
2.3.6洗脱速度
以1 ml min-1的流速，分别取四种供试品溶液各20mL进行吸附，分别以0.5 ml min-1、1.0 ml min-1.5 ml的流速，用50%乙醇进行洗脱。
从表7可以看出，洗脱速度为0.5 ~ 1.0 ml min-1。
3.5.7纯化松花粉总黄酮纯度检测
从表8可以看出，松花粉总黄酮经大孔树脂纯化后纯度可达80%以上，重现性好。
4结论
结果表明，D101大孔吸附树脂对松花粉黄酮的纯化效果较好，吸附率和解析率较高。研究了D101大孔吸附树脂纯化松花粉黄酮过程中，几种因素对上样效果和洗脱效果的影响。最终流程如下:样液浓度为0.358 mg/mL，样液流速为1 mL/min，用50%乙醇溶液以1 mL/min的速度洗脱3BV。松花粉中总黄酮的纯度可达80%以上。
参考
[1]中国保健协会健康专业委员会宣传部。国珍松花粉的药理研究与临床应用[J].健康咨询师，2005，17: 48-51。
[2]王敏。松花粉成分及药理作用的研究进展[J].安徽医学，2008，12 (4): 357-359。
[3]国家药典委员会。中华人民共和国* * *和国家药典[M]。第一部分北京:中国医学科技出版社，2010:333。
关于作者:
彭秀娟(1981-)，女，山东临沂人，研究生，讲师，研究方向:中药药效物质基础研究。