细胞和分子水平的生物检测是什么?
(1)预期靶标抑制活性的测定。随着农药作用于昆虫的靶部位,农药在昆虫体内的代谢解毒机制逐渐被人们所认识。通过检测受试药物对靶标或代谢物的作用,可以简化生物筛选的步骤和时间,这也是合理设计农药的重要思路。
(2)MTT法。MTT(甲基噻唑四唑)是一种黄色水溶性四唑蓝。活细胞中的琥珀酸脱氢酶能分解MTT产生紫色结晶颗粒,在细胞内和细胞周围积聚。它的量与细胞的数量成正比,也与细胞的活力成正比,但死细胞没有这种能力。因此,将处于指数生长期的细胞用一定浓度的药物处理后,加入MTT一段时间,然后测量所有混合液的光吸收值,就可以推断出细胞的活力,从而测出被测药物的毒性。
一般步骤如下:首先将昆虫细胞系,如棉铃虫细胞系、烟草蛾细胞系在96孔微量滴定板中培养一定时间(使细胞贴壁),然后加入待测化合物,继续培养24小时。在培养结束前,向孔中加入MTT母液一定时间,培养结束后,弃去上清液,然后向孔中加入一定的溶剂。放在酶联检测器上,在570nm处读取吸光度值,根据细胞死亡率初步判断化合物是否有活性。还可以设置一系列样品的浓度,最后得到LD50/LC50值来判断活性。
MTT法需要专用的无菌手术台和配套的细胞培养设备,成本较高。然而,这种方法需要较少的化学品剂量,可以很好地满足筛选技术的要求,如高通剂量筛选。
(3)生物传感器。生物传感器是以某些生物活性物质为敏感成分,结合物理和化学分析仪器,对特定种类的化学物质或生物活性物质具有选择性和反应性的分析装置。其关键技术原理是传感器的生物敏感层与复杂样品中特定目标分析物(如酶与底物、抗体与抗原、凝集素与糖、核酸与互补片段)的识别反应会产生一些物理化学信号的变化(如光与热、声音、颜色、电化学),这些变化通过不同原理的转换器(如光敏管压电器件、光电极光敏电阻、离子选择性电极等)转换成秒信号(通常情况下)。)
生物传感器按识别元件可分为三类:基于分子(酶、抗原或抗体、受体、核酸、脂质体等)的传感器。),基于细胞的传感器和基于组织切片的传感器。就敏感元件而言,前者是固定化的生物体成分,后两者是生物体本身。基于分子的生物传感器具有高度的选择性和灵敏性,并且只对目标分子做出响应。正是由于这种高选择性,一些具有相同功能的相关分子可能检测不到。以活细胞为检测单位,可以检测出很多未知物质。目前,生物传感器主要用于环境监测(生化武器、地下水污染等。)、药物筛选、新药开发和基础神经病学研究,它们在农药领域的应用正在起步。
例如确定昆虫电生理反应。原理是昆虫拒绝进食和药物刺激昆虫的味觉感受器(如中锥感受器)有一定的相关性。同时,用测试液刺激昆虫的中锥感受器。同时,电极与接收器相连,接收器发出的脉冲信号被电子设备接收并放大。这些信号被示波器或记录仪记录下来,或者直接输入计算机,通过专门的处理软件对信号进行分析,判断活动的存在或大小。在华南农业大学研究了炔烃和川楝素对亚洲玉米螟的拒食活性及其电生理反应。
(4)生物芯片。生物芯片技术,利用原位光导合成或微点取样等方法,将大量的生物大分子,如核酸片段、多肽分子甚至组织切片、细胞等生物样品有序地固定在支持物(如载玻片、硅片、聚丙烯酰胺凝胶、尼龙膜等载体)表面,形成致密的二维分子排列,然后与标记的待检测生物样品中的靶分子杂交。通过特定的仪器,如激光聚焦扫描或电荷耦合相机(CCD)快速、并行、高效地检测和分析杂交信号的强度,从而判断样品中靶分子的数量。
目前,生物芯片包括基因芯片、蛋白质芯片和组织芯片。在已知的昆虫控制靶标中,各种害虫的细胞、作用靶标或核酸片段可以同时在同一生物芯片上进行药物筛选。芯片技术具有高通、大规模、并行的特点,可以用来筛选新药,生物芯片技术还可以用来寻找潜在的药物靶点。利用该芯片进行大规模筛选研究,可以省去大量的动物实验,缩短药物筛选的时间。