胚胎干细胞培养是如何培养的？它的具体操作流程是怎样的？饲养层细胞是成纤维细胞，那么它的详细功能是什么？
目录
一.细胞
第二，常规培养——保持胚胎干细胞处于未分化状态
培养基
细胞恢复
冷冻细胞
明胶涂层
细胞传代
第三，体外分化
培养基
涂有聚鸟氨酸/纤连蛋白的培养板(有或没有盖玻片)
体外分化方法
第四，移植细胞的制备
细胞
多能胚胎干细胞在小鼠胚泡中产生。
1.表达绿色荧光蛋白的B5-ES细胞(EGFP)。纳吉博士的实验室准备的。
2.D3-ATCC；CRL-1934。我们拿到的时候，已经传了大概17代了。
3.j 1-由Jaenish博士实验室友情提供。我们拿到手的时候，大概传了7-9代。
4.J1 RTTA-RTTA表达J1细胞，由Jaenish博士的实验室友谊提供。
5.表达黄色荧光蛋白的YC5-ES细胞由Nagy博士的实验室提供。
常规培养-将ES细胞维持在未分化状态
ES细胞培养使用含有ESGRO(白血病抑制因子)的高糖培养基来阻止细胞分化。为细胞提供涂有0.1%明胶的平板，作为细胞粘附的基质。建议细胞每2-3天从80%-90%融合的平板上传代一次，比例为1: 8。细胞传代后，在将细胞接种到0.1%明胶包被的培养皿中之前，应通过将细胞接种到未包被的组织培养板中2小时来分离分化细胞和未分化细胞。细胞在37℃、5% CO2和65438±000%湿度下培养。
培养基
ES:
制备不含DMEM、HS和ESGRO的20倍溶液(该溶液也可用于EB培养基-见下文)。包装在50毫升FALCON试管中(稀释2倍，每管42毫升),储存于-20℃。通过将21毫升该溶液、HS和ESGRO加入450毫升DMEM中制备培养基，并用0.2μm滤膜过滤。储存在4℃下。注:一瓶DMEM是500ml。
储存液体
DMEM(高糖)
马血清
L-谷氨酰胺(200毫米)
MEM NEAA(10毫米)
赫普斯(1米)
β-巯基乙醇(55毫米)
害虫
埃斯格罗
复苏细胞
将细胞冷冻在10%二甲基亚砜(DMSO)中，以防止会损伤细胞的晶体形成。但二甲基亚砜对细胞有毒性，所以快速进行细胞复苏非常重要。
步骤:
1.从液氮中取出一管细胞；
2.将冷冻管放入37℃的水浴中2分钟(或者管内溶液刚好完全溶解)；
3.将细胞转移到15毫升Falcon试管中；
4.加入5ml ES培养基(用培养基冲洗冻存管)；
5.离心3分钟；
6.弃去上清液，用2ml ES培养重悬细胞，至少吹10次；
7.接种在涂有明胶的6孔或6cm组织培养皿中(见下文)；
8.孵化。
冷冻细胞
冷冻储存溶液
90% HS和10% DMSO
步骤:
1.1× PBS洗细胞，培养皿中留少许PBS；
2.用细胞刮刀收集细胞；
3.将细胞转移到15ml Falcon试管中，离心3分钟；
4.弃去上清液，将细胞重新悬浮在冷的冷冻溶液中(10cm培养皿为2ml，15cm培养皿为6-7ml。)
5.分装于冷冻管中，每管为1ml；
6.在-80℃放置过夜，第二天移入液氮中。
明胶涂层
准备500ml 0.1%明胶溶液。
1.将0.5g明胶溶于500ml不含钙和镁的PBS中(50-65℃水浴15 ~ 30分钟)。
2.溶液最好不经冷却，用0.2μm滤膜过滤，保存在4℃下。
涂层培养皿或皮氏培养皿
1.加入足够的明胶溶液覆盖培养平面(15cm培养皿2ml，10cm培养皿0.5 ~ 1ml)。溶液的量不重要，只要能完全覆盖培养面即可。);
2.室温放置30分钟；
3.取出明胶溶液，在室温下将培养板保存在包装袋中。最好将平板做成方形，防止明胶污染盖子，流出培养板。
细胞传代
建议细胞每2-3天传代一次。过度生长的细胞会降低细胞的自然分化率。我们建立了一种去除分化细胞的纯化方法。在将细胞接种到明胶包被的培养板上之前，通过将分化的细胞粘附到未包被的组织培养板上来除去它们。纯化步骤包括在以下方法中。
1.取出培养液；
2.1×无钙镁PBS洗涤；
3.加入1×胰蛋白酶EDTA(用PBS稀释的10×胰蛋白酶EDTA。)在37℃孵育5分钟。
4.加入ES培养基使胰酶失活；
5.将细胞转移到15ml离心管中，离心3分钟；；
6.去除上清液，将细胞重新悬浮在2毫升培养基中，并吹至少10-20次。
如果加入的培养基量少，将更容易分离细胞团。ES细胞容易聚集，因此在传代过程中小心分离非常重要。这可能会降低细胞的自然分化。
7.将细胞接种在未涂布的组织培养皿中(使用与开始时相同的规格)，并将其置于培养箱中2小时(在此期间分化的细胞将粘附，而ES细胞将保持悬浮)；
8.将含有细胞的培养基转移到涂有明胶的组织培养皿中(见下文)。吹气以确保细胞分散(如前所述，胚胎干细胞倾向于聚集成团)
9.建议采用1: 4-1: 10的比例通行(ATCC)。
保持细胞的通过率是非常重要的。在我们的经验中，1: 8的比例是好的，可以尽量减少细胞的自然分化。当使用不同规格的培养板进行细胞传代时，可使用表1计算传代比例。
体外分化
多能胚胎干细胞可以在体外和体内分化成各种类型的细胞。我们的体外分化方法有利于在最少量的培养基中选择神经前体细胞(步骤3)，在bFGF存在下扩增(步骤4)和在步骤5中最终分化。细胞在37℃、5% CO2和65438±000%湿度下培养。
时间表(总时间为27 ~ 34天)
第二步；4+1天第三步；4-10天第四步；4天内第5步；10-15天
培养基
EB
制备不含DMEM、FBS和ESGRO的20倍溶液(该溶液也可用于ES培养基-见上文)。包装在50毫升FALCON试管中(稀释2倍，每管42毫升),储存于-20℃。将21毫升该溶液和50毫升胎牛血清加入450毫升DMEM中制成培养基，用0.2μm滤膜过滤。储存在4℃下。注:一瓶DMEM是500ml。
储存液体
DMEM(高糖)
胎牛血清
L-谷氨酰胺(200毫米)
MEM NEAA(10毫米)
赫普斯(1米)
β-巯基乙醇(55毫米)
有害生物(p 104 u/毫升104微克/毫升
ITSFn和N3:
制备不含DMEM/F12的20倍溶液。分装于15ml FALCON管中(稀释至1×，ITSFn 7.05ml，N3 12.55ml)，用0.2μm滤膜过滤，保存于-20℃。将该溶液添加到DMEM/F12中以制备培养基，并保存在4℃下。
储存液体
DMEM(高糖)
转铁蛋白50毫克/毫升
胰岛素5毫克/毫升
亚硒酸钠300μM
孕酮(20μM)
腐胺(100μM)
有害生物(P104U/ml S104μg/ml)
层粘连蛋白100微克/毫升
纤连蛋白250微克/毫升
碱性rhFGF，10微克/毫升。
*在步骤4中，向N3培养基中加入bFGF，使最终浓度为10ng/ml。
ITSFn和N3培养基保存液的制备
使用无菌溶剂和稀释剂，并在分装前过滤溶液。如果溶液因为某种原因在分装前没有经过过滤，就需要在试管上标注出来，让别人在使用时知道该溶液不能直接用于细胞培养。
储存溶液溶剂、储存溶液、稀释剂和储存
转铁蛋白50毫克/毫升
胰岛素5毫克/毫升
亚硒酸钠300μM
孕酮(20μM)
腐胺(100μM)
有害生物(P104U/ml S104μg/ml)
层粘连蛋白(100微克/毫升)
纤连蛋白(250微克/毫升)
碱性重组人生长因子(10微克/毫升)
涂有聚鸟氨酸/纤连蛋白的培养板(有或没有盖玻片)
涂层溶液的制备
聚L-鸟氨酸，15微克/毫升
将75毫升聚L-鸟氨酸与425毫升1×PBS混合。储存在4℃下。
纤连蛋白，1微克/毫升
将0.5毫升纤连蛋白与500毫升500毫升1×PBS混合。
涂层工艺:
1.加入聚-L-鸟氨酸至少2-3小时(过夜也是可以接受的)。
2.多聚L-鸟氨酸的抽吸
3.加入纤连蛋白约1-2小时。
4.吸出纤连蛋白，晾干30分钟。
5.储存在4℃下
24孔板为200μl，6孔板为500μl。摇动培养板，确保溶液能够覆盖盖玻片或培养孔。有时需要剧烈摇动培养板。
体外分化方法
步骤1: ES介质
在LIF存在下维持细胞培养(ESGRO)
第二步:EB培养基
使用细菌培养皿去除LIF后，需要4天才能形成胚状体。
1.分散和纯化细胞(参见上面的细胞传代部分)
2.纯化2小时后，将细胞转移到含有ES培养基的50毫升Falcon管中，计数细胞，将适当体积放入15毫升管中，离心3分钟。
3.用2mlEB培养重悬浮细胞，至少吹10次，制成单细胞悬液。
4.一个15cm的细菌培养皿可以接种4 ~ 5× 106个细胞(1个完全融合的组织培养皿通常足以接种4个相同规格的细菌培养皿)。
5.2天后，更换培养基。
将胚状体转移到锥形管中，放置3-5分钟，使细胞沉淀。丢弃上清液，将细胞重新悬浮在新鲜培养基中，并将其接种到新的细菌培养皿中。
6.在EB培养的第4天，将细胞转移到未涂布的组织培养皿中(这是细胞移植步骤)。在1个组织培养皿中，放置1个细菌培养皿，在第三步前一天将胚状体附着在相同规格的培养皿上。
形成胚状体需要4天。在EB培养基中培养1天后，胚状体附着在组织培养皿表面。这一天被认为是第二步和第三步的分界线。
步骤3 - ITSFn培养基
在基本培养基中选择神经前体细胞。
1.胚状体在组织培养皿中接种一天后，培养基换成ITSFn培养基。
2.在此期间，并非所有的胚状体都已粘附，因此在移除培养基时应小心，以保持培养皿中的大多数胚状体。
3.保持细胞在ITSFn中培养约10天，并根据需要更换培养基-大约每隔一天。
观察细胞形态，第4 ~ 7天出现神经样细胞。当可以识别神经元样细胞时，进行步骤4。步骤的转换应该是在神经前体细胞出现第一个明确迹象后的几天，一般是从第6天到第3步的第10天。
第四步-N3培养基++碱性成纤维细胞生长因子
神经前体细胞在含有10ng/ml bFGF的培养基中培养用于扩增。
用1洗。PBS，并加入2ml 1×胰蛋白酶(15cm的1培养皿所需的胰蛋白酶量以上表体积为准)(10×胰蛋白酶EDTA用PBS稀释)。
在2.37℃下孵育5分钟。
3.用4mlEB培养基停止胰酶活性，将细胞转入锥形管中3 ~ 5分钟除去细胞团，将上清液转入新的离心管中离心。
4.将细胞悬浮在含有bFGF的N3培养基中。
5.将细胞接种在涂有聚-L-鸟氨酸/纤连蛋白的盖玻片上(最好将盖玻片放在24孔培养板或6孔培养板上，6孔培养板的每个孔放5块盖玻片。如果是塑料的，放4个盖玻片，最大化样本数量)。在24孔板中接种3.5×105/孔或在6孔板中接种1.7×106/孔。
6.2天后，更换培养基。
第五步-N3培养基
去除bFGF诱导神经前体细胞分化
1.将细胞接种在盖玻片上4天后，将培养基换成不含bFGF的N3培养基。
2.根据需要更换液体(大约每隔一天)
3.分化10 ~ 15天后固定化细胞。
去除培养基
PBS洗涤
加入4%福尔马林
在室温下放置30分钟。
PBS洗涤两次
储存在PBS中。使用含0.01%叠氮化钠的PBS进行长期储存。
移植细胞的制备
在胚状体形成后4天移植细胞(对应于体外分化过程的第二步，将细胞转移到组织培养板上)。如前面体外分化所述，在移植前4天胚状体开始形成。将胚状体移植到10cm的培养皿中通常还需要一天。
移植
1.将胚状体转移到15ml锥形管中，静置3 ~ 5分钟。
最好将细胞离心3分钟。让其沉降将去除更多的单细胞(包括死亡细胞),并且这些细胞可以被离心。
2.去除上清液并将胚状体重量悬浮在不含钙和镁离子的1×PBS中。
3.离心3分钟
4.去除上清液，加入1×胰蛋白酶(10cm培养皿，1ml)。
5.37℃水浴5分钟。
6.加入5mlEB培养基，小心吹约10次。
小心处理细胞非常重要，铺展时不要用力吹。
7.离心2分钟
8.吸出上清液，将细胞重新悬浮在500μl EB培养基中。
9.用光滑的巴斯德吸管仔细吹5次。
10.离心两次。
11.吸出上清液，将细胞重悬于100μl EB培养基中。
烟酸己酮可可碱标记的胚胎干细胞移植
1.配制10μg/ml烟酸碱性染料溶液(二苯酰亚胺，在冰柜118)。
2.将1mg(你能称出的最小量)加入5ml EB培养基中(制成200μg/ml)。
3.将溶液稀释至10μg/ml(100μl 200μg/ml溶液和1.9ml EB培养基)。
4.如上所述，将细胞重悬于2ml烟酸碱染色溶液而不是EB培养基中，以制备ES细胞悬浮液。
5.将悬浮液在室温(或冰上)放置30分钟。
6.离心2分钟
7.吸出上清液，将细胞重新悬浮在2ml EB培养基中。
8.重复一遍
9.离心2分钟
10.吸出上清液，将细胞重悬于100μl EB培养基中，置于冰上。这是我最近翻译的一篇关于胚胎干细胞的文章。翻译的不好，但是意思要准确。对不起，有两个表格没有寄出。哪位老师能告诉我怎么编辑它们？非常感谢！谢谢你丁！我也有一个好帖子！我找了很久，终于找到了。非常感谢！谢谢，还没用，先了解一下吧。再次感谢！谢谢你。谢谢您们。你有原件吗？
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干细胞的概念
干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞。它包括胚胎干细胞和成体干细胞。干细胞的发育受到许多内部机制和微环境因素的影响。目前，人类胚胎干细胞已经在体外培养成功。最近的研究发现，成体干细胞可以横向分化为其他类型的细胞和组织，这为干细胞的广泛应用提供了基础。
在胚胎发育过程中，单个受精卵可以分裂发育成多细胞组织或器官。在成年动物中，正常的生理代谢或病理损伤也会引起组织或器官的修复和再生。胚胎分化和成体组织再生是干细胞进一步分化的结果。胚胎干细胞是全能的，具有分化成几乎所有组织和器官的能力。成体组织或器官中的干细胞一般被认为是组织特异性的，只能分化成特定的细胞或组织。
然而，目前这种观点受到了挑战。
最新研究表明，组织特异性干细胞还具有分化为其他细胞或组织的潜能，这为干细胞的应用开辟了更广阔的空间。
干细胞具有自我更新能力，能够产生高度分化的功能细胞。干细胞根据存活阶段分为胚胎干细胞和成体干细胞。
1.1胚胎干细胞
胚胎干细胞
当受精卵分裂成胚泡时，内细胞团中的细胞就是胚胎干细胞。胚胎干细胞是全能的、自我更新的，并且能够分化成身体中的所有组织。早在1970，马丁·埃文斯就已经从小鼠体内分离出胚胎干细胞，并进行体外培养。直到最近，人类胚胎干细胞的体外培养才获得成功。
此外，胚胎干细胞(ES细胞)是高度未分化细胞。它具有发育全能性，可以分化成成年动物的所有组织和器官，包括生殖细胞。胚胎干细胞的研究和利用是生物工程领域的核心问题之一。对ES细胞的研究可以追溯到20世纪50年代，对ES细胞的生物学研究始于畸胎瘤干细胞(EC细胞)的发现。
目前，许多研究工作都是在小鼠ES细胞上进行的。例如，德国和美国的医疗团队去年成功地将ES细胞培养的胶质细胞移植到实验鼠体内。此后，密苏里的研究人员通过小鼠胚胎细胞移植技术恢复了瘫痪猫的部分肢体。随着对ES细胞研究的深入，生命科学家对人类ES细胞的认识进入了一个新的阶段。1998年底，两个研究小组成功培养了人胚胎干细胞，保持了胚胎干细胞分化为各种体细胞的全能性。这使得科学家利用人类胚胎干细胞治疗各种疾病成为可能。然而，对人类胚胎干细胞的研究在世界范围内引起了巨大的争议。出于社会伦理的考虑，一些国家甚至明令禁止对人类胚胎干细胞的研究。无论从基础研究还是临床应用的角度来看，人类ES细胞带来的好处都远大于可能对伦理道德带来的负面影响，因此对人类ES细胞研究的呼声也是如潮。
1.2成人干细胞
成年动物的许多组织器官，如表皮、造血系统等，都具有修复和再生的能力。成体干细胞在其中发挥了关键作用。成体干细胞在一定的条件下，要么产生新的干细胞，要么按照一定的程序分化成新的功能细胞，从而保持组织器官生长和衰退的动态平衡。以前认为成体干细胞主要包括上皮干细胞和造血干细胞。最近的研究表明，被认为不可再生的神经组织仍然含有神经干细胞，这表明成体干细胞无处不在。问题是如何找到和分离各种组织特异性干细胞。成体干细胞通常位于特定的微环境中。微环境中的间充质细胞可以产生一系列生长因子或配体，与干细胞相互作用，控制干细胞的更新和分化。
1.3造血干细胞没问题
造血干细胞是体内各种血细胞的唯一来源，主要存在于骨髓、外周血和脐带血中。今年年初，北京协和医科大学血液研究所的庞文新在肌肉组织中发现了具有造血潜能的干细胞。造血干细胞移植是治疗血液病、先天性遗传性疾病和多发性、转移性恶性肿瘤疾病的最有效方法。