大蒜脱毒繁殖的主要技术有哪些？

在离体培养条件下，大蒜的任何组织都需要适宜的基质、营养、温度、湿度、光照等条件来培养脱毒试管苗和试管鳞茎。同时，还需要适宜和适度的激素来诱导和促进愈伤组织、生根、发芽、生长发育、成苗和鳞茎膨大。具体要求如下:

①营养需求:

无机营养:氮、磷、钾、硫、钙、镁等大量元素和铁、锰、铜、锌、硼、钴、钼等微量元素是大蒜生长发育所必需的营养物质。培养基中的活性成分以离子的形式存在，一种类型的离子可以由一种以上的盐提供。

有机营养:包括氮源和碳源。为了使组织生长良好，往往需要在培养基中补充一种或多种维生素和氨基酸，其中维生素B1是必不可少的，维生素B3、维生素B6和肌醇可以促进大蒜培养组织的生长。

②基质:脱毒大蒜组织培养通常采用琼脂培养基作为基质，浓度一般为0.5% ~ 1.0%。

③激素:除了营养物质外，为了促进组织器官的生长，通常还需要从外源供给一种或几种植物生长调节物质，这些物质的需求量因外植体组织、培养阶段和增减目的的不同而有很大差异。

生长素:在组织培养中，生长素用于诱导细胞分裂和根分化。常用的生长素有NAA(萘乙酸)、IAA(吲哚乙酸)、IBA(吲哚丁酸)、NOA(萘氧乙酸)、2，4-D(二氯苯氧乙酸)等。其中NAA和IBA被广泛用于生根，并能与细胞分裂素协同促进茎增殖。2，4-D对外植体愈伤组织诱导是不可缺少的。不同的外植体对2，4-D浓度有不同的要求。茎尖需要0.1.25毫克/升的2，4-D MS培养基，试管苗茎需要0.5毫克/升的2，4-D MS培养基。

细胞分裂素:主要促进细胞分裂和愈伤组织或器官不定芽的分化，帮助腋芽从顶端优势的抑制中解放出来，促进茎的增殖。常用的细胞分裂素有BAP(苄氨基嘌呤)或6-BA(6-苄基腺嘌呤)、ZT(玉米素)和KT(激动素)，其中6-BA是最常用的。

赤霉素:具有促进大蒜茎尖多芽、稳定微管、拮抗鳞茎形成的作用。赤霉素有20多种，主要由根供给。去根可以促进叶鞘细胞的膨大，有利于鳞茎的形成。大蒜鳞茎形成过程中，赤霉素含量先降低后升高，赤霉素含量的降低有利于鳞茎的形成。长日照诱导大蒜植株赤霉素含量降低是事实，因此长日照对鳞茎形成的促进是通过影响内源赤霉素水平实现的。

乙烯:乙烯通过改变细胞壁的形状和纤维素微纤丝的排列方向来刺激叶鞘细胞的横向扩张，而不是纵向伸长。此外，乙烯还能通过抑制叶片生长，诱导叶片衰老，改变叶身和叶鞘长度的相对比例，有利于鳞茎形成。

④ pH要求:灭菌前，培养基的pH值一般调节到pH 5 ~ 6。当pH<5小于5时，培养基(琼脂)不能凝固；当pH > 6时，培养基会变硬。然而，熊(1999)观察到蒜苗在pH=6.4时生长最好，增殖最快。刘(1995)认为徐州白蒜和太仓白蒜的芽分化、发根和芽生长的最适培养基为pH = 7.5(微碱性)。

⑤温度和光照要求:

温度:大蒜试管苗培养中，温度一般为15 ~ 20℃，较低的温度和较大的温差有利于培育壮苗；离体蒜苗必须经过一个低温(< 20℃)的春化阶段，然后进入更高的温度和更长更强的光照条件，以诱导蒜薹的形成和膨大。大蒜鳞茎离体形成和膨大的适宜温度为20 ~ 25℃。

照度:照度的要求本质上是对光周期、光强和光质的要求。

光周期:试管苗培养的光周期为12小时。光周期的长短对鳞茎形成非常重要，较长的日照条件有利于鳞茎膨大。然而，鳞茎形成对光周期反应的要求因大蒜品种的生态型而异。比如对低温反应慢的大蒜品种，一般在12小时日照下不形成鳞茎，16小时日照后虽能形成鳞茎，但发育迟缓；而对低温敏感的大蒜品种在12小时日照下鳞茎发育良好。

光照强度:在一定的光照周期内，强光下比弱光下更容易形成鳞茎。光照强时，合成的碳水化合物会增多，其积累是鳞茎膨大的物质基础。而诱导鳞茎形成，即使在弱光下，只要光照时间超过临界期，也能开始形成鳞茎。

光质:用白炽灯为大蒜补光，能明显促进试管鳞茎的形成和膨大。光敏色素的光平衡φ值与光质有很大关系，通常用R∶FR(红光:远红光)的光量子比来衡量。随着R∶FR值的降低，鳞茎膨大速度加快，光质在鳞茎形成中起重要作用，可能与其内源乙烯生成有关。

(2)脱毒大蒜组织培养基的制备

①配制浓缩原液:浓缩20倍的常量元素、200倍的微量元素、200倍的铁盐、200倍的除蔗糖外的有机物。在制备这四种储备溶液时，每种成分都应单独溶解，然后将它们相互混合。

各种激素的原液要分开配制。若不溶于水，应先用少量适当的溶剂溶解，再用蒸馏水定容。根据所需激素浓度水平，原液浓度可为0.001 ~ 0.05438+0微摩尔/升。生长素一般溶于95%酒精或0.01微摩尔/升氢氧化钠中，后者更有效。细胞分裂素一般溶于0.5 ~ 1微摩尔/升的盐酸或稀氢氧化钠溶液中。赤霉素易溶于冷水，但GA3不稳定，溶于水后易分解。最好用95%的酒精做母液。

所有储备溶液应储存在合适的塑料瓶或玻璃瓶中，并保存在冰箱中。铁盐储备溶液必须储存在棕色玻璃瓶中。在使用这些储备溶液之前，轻轻摇动瓶子。如果发现其中有沉淀物、悬浮物或微生物污染，必须立即清除。配制原液和培养基时，应使用蒸馏水或去离子水和高纯度化学试剂。

(2)制备培养基的步骤。

A.称取规定量的琼脂和蔗糖，加水至最终体积的2/3，加热溶解。由于蔗糖易溶，也可以在琼脂溶解后加入。

b、分别加入一定量的各种原液。如果因特殊原因需要在高压灭菌后加入维生素和激素，这些物质的溶液可以在调节pH值后通过微孔过滤器(孔径为0.22 ~ 0.45微米)进行消毒。

c .向培养基中加入蒸馏水至最终体积。

D.充分混合后，使用0.1微摩尔/升。使用氢氧化钠和0.1微摩尔/升盐酸来调节培养基的pH。

E.趁热将培养基(即使是液体)分装到选定的培养容器中(约1/3的容器容积)。

f .用纱布包裹的棉塞或其他合适的塞子或盖子如铝箔和牛皮纸密封瓶口。

G.用121℃，1.15×105帕斯卡灭菌15 ~ 20分钟。

H.让培养基在室温下冷却后低温保存，所有培养容器都必须做好标记，以便在高压灭菌和保存后可以清楚地识别。

(3)脱毒大蒜微繁操作技术

①脱毒大蒜组织培养的技术体系可以是试管苗，也可以是试管鳞茎。可以从外植体直接诱导芽的再生和增殖，以维持物种的稳定性，也可以先诱导愈伤组织，再增殖分化。因此，大蒜组织培养可分为四种途径:一是诱导外植体再生试管苗；其次，直接诱导外植体形成试管苗；三是诱导愈伤组织再生植株，在试管中形成小鳞茎；四、直接萌发形成的试管苗在试管内形成小鳞茎。

由于通过愈伤组织途径容易发生变异，本着保持品种优良特性的原则，在脱毒繁殖过程中应慎用。

②脱毒大蒜组织无菌培养的一般步骤:

A.将蒜瓣(或切碎的蒜茎)放入玻璃瓶中，在超净工作台上用75%酒精对表面消毒5分钟(或40秒)，然后在消毒剂(如0.2%氯化汞溶液)中加入几滴活化剂，适当浓度，消毒20分钟或12分钟。消毒时摇晃玻璃瓶2 ~ 3次。

B.消毒后，倒出消毒液，加入适量无菌蒸馏水，摇匀数次，倒掉水，如此反复3-4次。

C.取出材料，放入已灭菌的培养皿中。

D.在对大蒜材料进行消毒的同时，通过将它们浸泡在95%的酒精中，将它们取出，在酒精灯的火焰上燃烧，并在冷却后使用它们来对要使用的设备进行消毒。所有器械每次使用后经常需要消毒1次。

E.使用这些灭菌的器械从表面灭菌的材料上切下合适的外植体茎尖。

f .打开培养容器的盖子或塞子，将外植体接种到培养基上。如果使用玻璃容器，在酒精灯火焰上烘烤瓶口几秒钟，然后迅速用瓶盖或软木塞密封。

G.培养基和器具的灭菌应通过常规方法进行，即高压灭菌。

③脱毒大蒜离体快繁技术:

A.直接诱导外植体形成芽和根。不定芽和根是由外植体直接诱导产生的，一般要经过初代培养、不定芽诱导和生根培养的过程。各种外植体在MS、B5和LS培养基上都可以再生出完整的植株。

细胞分裂素的存在是芽形成的前提。较高浓度的BA能促进芽的形成，添加1 ~ 2 mg/L BA能诱导芽的形成。无激素培养基有利于生根，培养基中添加NAA促进生根，添加BA抑制生根。

不同来源的外植体需要不同的激素。花芽再生芽只需0.1 mg/L NNA MS培养基。低浓度生长素(NAA)结合高浓度细胞分裂素(KT)是从大蒜花瓣芽分化的最佳组合。芽的增殖需要生长素的浓度高于细胞分裂素。添加0.1 mg/L玉米素(ZT)能促进带嫩叶茎段不定芽分化，形成丛生芽。添加一定浓度的GA3有利于茎尖诱导。青霉素的存在有利于芽的形成，减少污染。

贮藏温度对胚珠产生影响因外植体而异。蒜瓣在5℃贮藏后能促进芽和根的形成。而5 ~ 7℃低温处理气生鳞茎60天，只促进发芽率，不影响芽数。不同部位发芽能力差异很大。只有带节的茎段培养才能诱导萌发，茎段的其他部分无效。

B.试管苗的驯化和大田生长。一般来说，试管苗需要用蛭石、岩棉、珍珠岩等进行驯化培养。作为基质，用营养液浇灌。移栽时接种藓类球囊霉能促进试管苗生根，提高成活率。小鳞茎移栽苗的成活率为92%，显著高于小鳞茎移栽苗(53%)。

④脱毒试管鳞茎微繁操作技术:试管鳞茎的培养一般要经过初代培养、芽增殖和试管鳞茎形成三个阶段。大蒜离体培养形成鳞茎的例子有:外植体起始、愈伤组织诱导和试管苗生根。利用茎尖、茎盘、带幼叶的茎盘、重鳞和花芽等外植体，可在MS、B5或LS培养基上形成试管鳞茎。

低浓度激素(BA、)促进鳞茎形成，即使无激素培养基也是优越的。以茎尖为外植体时，低浓度的激素促进鳞茎的形成；当茎盘为外植体时，2 mg/L BA促进鳞茎形成，高浓度BA促进芽形成。NAA有利于小鳞茎根的形成，培养基中1.0 mg/L NAA使80%的小鳞茎根形成。鳞茎在2毫克/升NAA+0.05毫克/升BA的MS培养基上形成，没有激素膨胀。

较高浓度的蔗糖(90 ~ 1.20g/L)有利于鳞茎的形成。培养基中添加(5g/L)活性炭可促进鳞茎形成。长光和远红光促进鳞茎的形成和膨胀。

不同生态型在相同的离体条件下形成的鳞茎在数量和质量上存在差异。在离体条件下，春秋品种试管鳞茎形成对光周期的要求有显著差异。3 ~ 4℃低温预处理促进鳞茎形成，春蒜品种必须经过低温预处理才能形成鳞茎。

环境条件对鳞茎形成的诱导不能通过改变培养基的成分来代替。试管鳞茎不经驯化直接移植。试管鳞茎的大小与田间发芽率、株高和产量呈正相关。试管鳞茎的大小和种植密度影响鳞茎的产量和质量。形成的鳞茎(晚熟品种)可在35 ~ 20 ~ 5℃打破休眠。

熊等(1999)以徐州白蒜的脱毒试管苗为外植体。经过初始培养基、继代培养基和鳞茎诱导培养基的连续培养，鳞茎诱导率达到90%，鲜鳞茎重300 mg以上，鳞茎直径达到15 mm。

⑤提高微繁殖系数:

A.选择合适的外植体。芽是脱毒大蒜快速繁殖的基础，诱导外植体直接产生脱毒多芽可大大提高快繁基础。

大蒜品种间茎尖芽数存在明显差异。休眠鳞茎顶端的芽数明显少于打破休眠的鳞茎。低温处理能明显增加芽数，去皮芽的大小也影响芽数。具有2 ~ 3个叶原基的大苗比具有1叶原基的小苗出芽多，但大苗的脱毒率低于小苗。鳞茎在37℃热处理20 ~ 30天时，茎尖的脱毒率与茎尖相近。因此，先对鳞茎进行热处理，然后剥去大茎尖进行培养，可获得多个脱毒率高的芽。

蒜薹能产生许多气生鳞茎，说明它有很强的腋芽萌发潜力；同时，作为生殖器官和分生组织，生殖茎尖具有更多的腋芽原基和更强的脱毒潜力。不同大蒜品种间生殖茎尖的芽数存在明显差异，很多芽往往长势较弱，需要切取分离很多芽进行壮苗培养。

B.提高世代增殖系数。及时剪去初始培养基中形成的芽，是提高继代培养增殖系数的关键环节。培养基中激素的种类、浓度和比例，以及愈伤组织的诱导、分化和鳞茎形成，都会影响世代的增殖系数。

愈伤组织诱导:在MS、B5、改良B5(BDS)、LS和N6中均可诱导出愈伤组织。不同的外植体对激素的要求不同。茎尖和叶片在含有1 ~ 2 mg/L IAA或0.05 ~ 1.0 mg/L 2，4-d的培养基上有较好的愈伤组织诱导率，2，4-D和KT是诱导花梗形成愈伤组织所必需的。添加2，4-D后，花芽会形成愈伤组织。花药在含2 mg/L NAA的B5培养基中培养，愈伤组织诱导效果较好。分生根瘤(MRTs)的形成需要低浓度(0.5毫克/升)的NAA，不需要KT，根瘤的形成与正常的生根能力负相关。低温贮藏促进了大蒜愈伤组织的形成，但在没有2，4-d的情况下，低温预处理不能促进大蒜愈伤组织的形成。花药在5℃下预处理1 ~ 2d有利于愈伤组织的诱导。

愈伤组织增殖:愈伤组织生长一般不需要光照，适宜温度为25℃。在定轨摇床培养中，70转/分有利于愈伤组织生长，150转/分促进球体形成，然后可以再生幼苗。茎尖愈伤组织在高浓度BA和NAAR的MS培养基中增殖和生长最快。2 mg/L的IAA促进愈伤组织生长，而IBA和BA不促进愈伤组织生长。

愈伤组织分化:愈伤组织分化通常需要光照。不同来源的愈伤组织具有不同的分化能力。叶原基愈伤组织比茎尖愈伤组织更容易分化。来自花药的外植体最有利于芽的形成、增殖和生根，畸形根容易分化出不定芽，最佳为0.5 mg/L IAA+5 mg/L BA。由于MRTs形成的愈伤组织具有良好的器官发生能力，分生根瘤可以作为良好的外植体。来自小根和花梗的愈伤组织比来自大根和花梗的愈伤组织更容易再生芽和根。

芽和根的分化条件不同:高浓度的NH4+有利于芽的分化。BA对幼苗分化是不可缺少的。无2，4-D有利于再生，王宏龙报道高浓度细胞分裂素和低浓度生长素有利于芽分化，可在无激素MS培养基上生根。低浓度的BA和NAA有利于植株再生。

不同来源愈伤组织的分化需要不同的激素。花芽愈伤组织在2，4-D存在下可分化出芽和根，试管苗根尖形成的根瘤分生组织在MS培养基0.5 mg/L NAA或0.5～1.0mg/L NAA+1.0mg/L KT中可再生为完整植株。愈伤组织分化需要不同的激素和不同的培养基。不定芽在B5培养基中需要高浓度的KT (2 ~ 4 mg/L)，在LS培养基中需要低浓度的BA(0.25 mg/L)。花药愈伤组织在B5培养基上的分化效果优于LS培养基。花梗愈伤组织的低温处理是芽分化所必需的。当代植物由愈伤组织分化而来，由于根主要从愈伤组织中生长，而不是从幼苗基部生长，最终导致根芽分离，移栽成活率仅为10% ~ 20%。有效的解决办法是直接从幼苗诱导出鳞茎。

愈伤组织的变异:愈伤组织形成过程中的染色体变异可能与生长调节剂的种类和浓度有关。Dolezel等用BDS培养基研究发现，5 ~ 50 μ mol/L的NAA使有丝分裂异常的细胞数增加，但当总激素浓度达到500 μ mol/L时，有丝分裂活性明显抑制，有丝分裂异常，因此较低浓度的激素可使细胞有丝分裂正常化。

随着继代时间的延长，变异加剧。愈伤组织继代培养4个月后，二倍体从开始的52%下降到16%，再生频率降低。继代培养一年后，芽分化率由60%下降到10%。1 ~ 3 Gy能促进愈伤组织生长而不影响幼苗再生，可用于突变体筛选。

综上所述，所有使试管苗健康生长，提高试管鳞茎诱导率，促进其扩大的因素都会影响脱毒大蒜微繁系数的提高。

⑥注意事项:

A.病毒检测。尽管小心地切下茎尖并进行各种处理以消除病毒，但只有一些培养物能产生无病毒植株。因此，对于茎尖生产的每一株植物，在作为母株生产无病毒原种之前，必须对其进行特定病毒的检测。培养植物中的许多病毒有一个延迟的恢复期。因此，在最初的18个月中，必须对植物进行多次测试。只有那些确实清除了一种病毒的，才能在生产中推广使用。因为经过病毒测试的植物仍然可能被再次感染，所以在育种过程中和所有阶段都需要重复测试。这些无病毒植物必须在能消除任何感染可能性的条件下繁殖。

B.优化菌株。培养的后代按生长势分类，每次选择生长一致的植株进行继代培养，个体生长充分，不会受到抑制。

c、适时诱导鳞茎形成。试管鳞茎的培养一般要经历初代培养、芽增殖和试管鳞茎形成三个阶段。但芽增殖阶段不能无限期进行下去，必须及时诱导鳞茎形成。试管鳞茎的形成需要一定的幼苗生长，在气温较高的夏秋季节诱导鳞茎形成，以降低生产成本，并与田间生长季节相衔接。

D.及时更新，防止玻璃化。当无菌培养方法建立后，很容易连续繁殖，不与原始亲本植株进行比较，这可能使培养早期发生的变异积累起来。同时，根据研究经验，如果在试管内重复繁殖，一些培养物的叶片往往会变得渍水，几乎半透明，这种试管苗的生长繁殖速度会下降，最后甚至死亡，这就是玻璃化现象，很难完全消除。所以要注意及时升级，防止玻璃化。