参考肝星状细胞的培养

1.1动物准备雄性SD大鼠，体重500g左右，常规饲料喂养，正常饮水。HSC分离前每天服用维生素a Mina 2周。

200IU/100g注入胃管。

1.2.主要试剂和仪器

1.2.1试剂:胶原酶

四。链霉蛋白酶，小鼠VEGF，脱氧核糖核酸酶，RPMI1640培养基，胎牛血清，马血清，Percoll。

1.3肝星状细胞的分离纯化

分离当天肌肉注射氯胺酮(0.2ml/100g)和肝素(150IU)麻醉，然后严格消毒。放在无菌超净台上，仰卧位固定。剖腹术后门静脉插管和灌注。具体操作如下:取大十字切口，上至剑突，下至耻骨联合，左右至双侧腋中线。皮瓣外翻，露出腹腔内的所有器官。将小鼠小肠向左侧转动，可以看到肝门处的门静脉由脾静脉和肠系膜静脉汇合而成。释放双侧肾静脉上方的肝下腔静脉。游离肝脏上方的肝膈面，向下按压肝脏，切断镰状韧带至肝脏上下腔静脉。将9号输液针插入门静脉，固定动脉夹，转动灌注泵。同时快速夹闭肝上下腔静脉，提前切开肾静脉，开始整个原位灌注过程。

首先，使用200ml含有葡萄糖1.0g/L和肝素5000IU/L的D-Hank溶液，并在水浴中以20ml/min的流速加热至39℃。尽量把肝脏里堆积的红细胞冲出来。然后用酶灌注液，0.05 mmol/lca2+，0.05%胶原酶IV，0.08%蛋白酶e，4.8 g/l。

Hepes (pH 7.4-7.6)，5% FCS-Hi的D-Hank溶液(100ml)，流速为5 ml/min，用于消化肝脏。20分钟后，用无菌剪刀剪下肝组织，放入干净的培养皿中，进入细胞室进行以下操作。从培养皿中取出肝被膜和格利森鞘。将肝脏粉碎成糊状，放入含0.05%胶原酶IV、0.001% dnasei和5.3%FCS-HI(V/V)的PBS中，37℃水浴振荡30分钟，使肝组织充分消化。消化后的肝组织用100目钢丝筛选，失败的肝组织用玻璃注射器针芯研磨，用RPMI1640培养液洗涤。将过滤后的肝组织放入50mlFalcon离心管中，加入RPMI1640培养液至50ml，温度为20℃100x。

g离心5分钟，去除大部分肝实质细胞。将上清液转移到另一个Falcon试管中，并以350x g离心65438±00分钟。将沉淀物再次悬浮于50mlRPMI1640培养基中350倍。

g离心10分钟。将沉淀物重悬于16ml PBS中，并分两部分梯度加入Percoll顶层。Percoll的密度梯度分为三层:自上而下20%(密度~1.012

G/ml)20ml，35%(密度~ 1.014g/ml)15ml，50%(密度~ 1.018g/ml)10ml。铺设后4℃900x。

g离心30分钟。轻轻取出，不要晃动液面，这样20% Percoll层中间有一个浑浊带。插入针号。液面下16，此处吸约10ml。加入RPMI1640培养基至50毫升，900倍。

g离心10分钟，将沉淀重悬于RPMI 1640+199的混合培养基中，加入10%胎牛血清、10%马血清和10 ng/ml VEGF。计数细胞产量并进行台盼蓝排斥试验以判断活力。

1.4

细胞培养

对重悬的细胞进行计数后，将1.5x 106/孔接种到覆盖有胶原蛋白s的24孔板中。10分钟后，将细胞悬液重新吸入新孔中。3天后第一次换液，以后视情况每2-3天换一次液。如果需要免疫组织化学分析，可以将细胞接种到内部装有载玻片的6孔板中。当细胞融合达到80%-90%左右时，即可传代。传代时常规使用0.1.25%胰蛋白酶。

1.5细胞的鉴定

细胞纯度的鉴定3天后，当细胞呈梭形时，高倍镜下每个孔随机选取10个视野，每个视野至少计数200个细胞。波长为325nm的紫外光激发细胞自发荧光。光镜和透射电镜观察细胞形态。免疫组化法鉴定原代和传代造血干细胞

结蛋白和α-SMA的表达。