细胞学问题
体外培养经历了100年左右的历史,但最初的发展过程比较缓慢,没有引起很多学者的重视。直到20世纪50年代后期,体外培养技术才被广泛应用于生物学研究的各个领域,从而导致了这项技术的快速发展。现在体外培养已经成为细胞工程、基因工程和抗体工程的重要组成部分。
细胞培养是指将取自生物机体的某些组织分散成单细胞或直接取自机体,或将体外培养的细胞分散成单细胞,在体外培养,使细胞继续存活和增殖。在培养过程中,细胞不再形成组织。
细胞培养技术的发展和完善主要集中在防止污染、改进培养方法、设计新的培养容器和设计不同的培养液。
用1885 Roux生理盐水培养鸡胚组织;
1903的Jolly,1906的Beebe等等。发明了挂盖滴文化;
哈里森于1907年成功培养蛙胚胎神经,并开始创造凹面玻璃罩悬滴培养法;
1910、1912中的Carrel通过无菌操作、培养基更新、传代等方法对悬滴培养法进行了改进。
Maximow在1924采用双盖悬滴培养法;
1923年,卡拉尔设计并创立了卡德尔摇瓶培养法。用这种方法可以根据需要随时更换培养液,不仅有利于组织的持续生长,而且可以用不同种类的营养液培养不同的细胞,大大促进了当时组织培养的研究。
Earle等人对其进行了改进,使大量细胞可以直接在玻璃瓶壁上生长,培养出正常细胞和肿瘤细胞的细胞系。到目前为止,大多数研究人员使用培养瓶培养细胞。
组织培养自20世纪40年代以来发展迅速,在培养容器、培养基和培养技术上有许多创新。
在培养容器方面,从试管和旋转管中的简单培养到各种培养瓶,近年来,塑料瓶、培养皿和多孔培养板的使用日益普遍。
培养基方面,从50年代初,Parke和Eagle设计合成培养基,从纯天然培养基到合成培养基,从鸡胚提取液到动物血清(细胞生长促进剂),直到60年代,设计无血清培养基。
首先体现在设计不同种类的缓冲盐溶液来培养不同的细胞并进行洗涤。厄尔在1948设计了含碳酸氢钠的厄尔盐溶液,汉克在1949设计了汉克盐溶液。
在文化技术和方法方面,创新进展更为迅速。Earle和Dulbecco在1943中创造了单层细胞培养方法,并首次建立了L细胞系。
1948年,桑福德建立了单细胞分离培养方法,获得了纯L细胞系。
1951年,Gey首次建立了人类肿瘤细胞——HeLa细胞系。
1961年,Hayflick首次建立了25种人类二倍体细胞系,开辟了新的应用方向。
自20世纪50年代末以来,组织培养技术的应用进入了一个繁荣的阶段,并被广泛应用于生物学和医学研究的各个领域。
通过诱变建立遗传缺陷细胞系,利用杂交瘤技术制备单克隆抗体,发展细胞大量培养技术,利用重组技术构建工程细胞系,已成为生物工程的重要生产方法。
在连续灌注培养技术方面,Ohashi,Ryo等人在2001中报道了用2L一次性生物反应器灌注杂交瘤细胞产生单克隆抗体。以Becton Dickenson细胞Mab+10%胎牛血清+1%聚醚F-68为培养基,最高活细胞密度超过1× 65438。在2001中,Heine,Holger,Switzerland在具有超声波细胞分离器(UCS)的连续灌注搅拌罐生物反应器中培养小鼠杂交瘤细胞以产生单克隆抗体。稳态培养的活细胞密度超过2× 107个/ml。2004年,德国Thomas等在1L搅拌罐式生物反应器中培养rCHO细胞生产人MUC-1糖蛋白,采用葡萄糖浓度限制的高产量灌注工艺减少有害代谢物,代谢转向TCA循环增加,活细胞密度保持在(1 ~ 2) × 107细胞/ml。
在流加悬浮培养技术方面,麻省理工学院的谢良智等人在2000年报道了杂交瘤细胞在2L生物反应器中进行流加培养,通过营养控制降低氨和乳酸的比生产率。补充培养基含有营养物质、胎牛血清和微量金属,最大活细胞密度达到1.7×107个细胞/mL。
细胞分离是通过物理、生物和化学方法将生物组织分离成单细胞分散体系的过程。
一般动物组织培养后,其细胞会在培养基表面生长,自行达到细胞分离的目的。也可以用胶原酶处理分离。
但植物组织培养后会形成愈伤组织,需要用化学方法获得单细胞(通常是纤维素酶)。