细胞悬浮培养技术

1.用镊子取出旺盛柔软的胼胝，放入三角瓶中，轻轻捏碎。每100ml三角瓶中装有10~15ml灭菌MS培养基，每瓶接种1~1.5g愈伤组织，保证初始培养有足够的细胞。

2.将接种过的三角形放在旋转摇动器上。在65438±000转/分、25～28℃的条件下进行摇瓶培养。

3.培养6~10天后，若细胞增殖明显，可在培养瓶中加入10ml新鲜培养基，必要时用大口吸管将培养物分两瓶继续培养。(如果细胞没有明显增殖，可能是起始材料不合适，应考虑在旺盛增殖期重新接种愈伤组织)。可以进行第一次继代培养。

4.悬浮培养的过滤:按“3”法传代培养几代后，培养液应主要由单细胞和小细胞团组成(不超过20个细胞)。如果还含有有效的大细胞团，可以用适当孔径的金属网筛过滤，然后将过滤后的县内漂浮细胞继续培养。

5.细胞计算。取一定体积的细胞液，加入两倍体积的8%三氧化铬(CrO3)，置于700℃水浴中65438±05分钟。冷却后，用移液管反复吹细胞悬液，使细胞充分分散。混合后，取一滴县液，放在血细胞计数板上计数。

6.制作细胞生长曲线:为了了解县城漂浮培养细胞的生长动态，可采用以下方法绘制生长曲线:

(1)新鲜称重法

在传代培养的不同时间，离心收集一定体积的悬浮细胞培养物，称重细胞鲜重，以鲜重为纵坐标，培养时间为横坐标，绘制鲜重的生长曲线。

(2)干称法。

称重鲜重后，可将细胞干燥，然后称重干重。以干重为纵坐标，培养时间为横坐标，绘制细胞干细胞再生曲线。

以上两种方法需要每两天取样一次，* * *七次，每个样品重复三次。在整个实验过程中，没有新鲜的培养液被换入培养瓶中。

7.细胞活力的检查。对于初学者来说，经常需要检测活细胞的比例。在培养的不同阶段，可以吸取一滴细胞液放在载玻片上，滴一滴0。用1%苯酚藏红花溶液(用培养基制备)染色，并在显微镜下观察。有几个活细胞是不着色的，而死细胞很快就被染成红色。也可以用0。用1%荧光二乙酸盐溶液染色，所有活细胞在紫外光的诱导下都会呈现蓝色荧光，有经验的操作者可以根据细胞形态和胞质循环来判断细胞的生死。

8.细胞再生能力的鉴定:为了知道悬浮培养的细胞是否还有再生能力，可以将培养的细胞转移到琼脂固化的培养基上，使基部再次形成愈伤组织，然后在分化培养基上诱导植株的分化。