单核细胞增生李斯特菌生物膜的制备方法

1.将-80℃冻存的菌株接种到固体BHI培养基中，37℃培养65438±08h活化。选择单菌落，在5mL液体BHI培养基中于37℃和200转/分钟培养过夜。第二天按1:100的比例转接到1L新鲜液体BHI培养基中，继续培养至OD600为1.0。

2.2.2超滤浓缩提取膜囊泡当细菌培养至OD600为1.0时，4℃6000 r/min离心20min收集上清液，用0.45μm或0.22μm滤膜过滤，然后转入分子量为100kD的超滤浓缩管，4℃4000 r/min离心20min。取浓缩液，4℃，365，438+065，438+074 r/min离心3小时，弃去上清液，用65，438+00 ml磷酸盐缓冲液悬浮沉淀，重复离心一次，将沉淀重悬于65，438+0 ml磷酸盐缓冲液中，用0.22μm滤膜过滤，无菌检查，保存于-80℃。提取的EGDe、EGDE δ PRFA和EGDE δ PRFA+Perl3-PRFA *的膜囊泡分别表示为EGDe-MVs、δδprfA-MVs和prfA*-MVs。

3.通过Optiprep密度梯度离心提取膜囊泡用浓度分别为25%、30%、35%、40%和45%的DMEM制备Optiprep梯度离心溶液。吸取超滤浓缩法提取的1mL产物(同1.2.2)，转移至贝克曼离心管，然后依次加入45%、40%、35%、30%、25% opti prep 2mL，4℃，31174r/。离心后仔细收集贝克曼离心管中30%-35%的组分，加入10mL磷酸盐缓冲液，再次超速离心。重复离心三次后，弃去上清液，沉淀物重悬于1mL磷酸盐缓冲液中，经0.22μm滤膜过滤，无菌检验，保存于-80℃，即为提取的膜囊泡。

4.用BCA法测定膜囊泡的蛋白质浓度，计算膜囊泡的产量。MVs蛋白浓度的具体测定方法，请参考BCA蛋白浓度测定试剂盒说明书。用稀释平板涂布法计数OD600为1.0时的菌落数，用每1013 CFU获得的蛋白质量确定膜泡的产量。

5.负染电镜观察膜泡形态。将铜网浸泡在MVs样品中约20分钟，然后取出。用滤纸垂直接触铜网，去除多余的液体。然后将铜网浸泡在PTA染料溶液中5分钟，取出后自然阴干2-3天，即可用于电镜观察。

6.对细菌生物被膜形成的影响培养和细菌生物被膜的检测参见凤飞飞等【10】。将3个菌株的MVs稀释至相同浓度(0.2mg/mL)后，将100μL对应的MVs按1:1的比例加入到含有100μL菌液(同菌株或不同菌株)的96孔板中。此外，还设置了两组无MVs的参照:一组加入等量的菌液，另一组加入等量的磷酸盐缓冲液。上述操作后，96孔板在37℃下分别培养24、48和72小时。相应培养时间后，用酶标仪测定OD600值，检测其生长情况。随后，丢弃每个孔的培养基，用蒸馏水洗涤生成的生物膜，室温干燥，用1%草酸铵结晶紫染色，并测定其光吸收值OD595。实验数据用Origin8和SPSS22进行分析。用结晶紫染色的生物膜在倒置显微镜下直接观察，并拍照和记录。

7.膜囊泡溶血活性的检测溶血活性的测定参考了Xinhui等[12]的方法。将来自不同菌株的MVs稀释至相同浓度(0.2mg/mL)后，将一定量的MVs加入到含有1mL红细胞悬液的离心管中，阴性对照组加入相同量的磷酸盐缓冲液，阳性对照组加入相同量的无菌水。另外，在1毫升红细胞悬液中加入等量的MVs，再加入2毫摩尔/LDTT。离心管37℃孵育3小时，然后室温2600r/5min离心5分钟，吸取800μL上清液，测定一次性比色皿中OD543的值，即为MVs的溶血活性值。

8.膜泡对棉铃虫幼虫体重、存活率、化蛹率和发育时间的影响[13]。将不同品系的MVs稀释至相同浓度(0.2mg/mL)后，在仔鱼第一腹足下吸收并注射5 μm-MVs，对照组注射等量的磷酸盐缓冲液，每组18只仔鱼。注射后，每24小时称一次幼虫的重量，统计存活率、化蛹率和幼虫发育时间(从购买之日到最后一龄)。数据的计算方法为:化蛹率=蛹数/试验昆虫总数×100%；存活率=存活数/试虫总数×100%。