植物细胞悬浮培养系统的作用是什么，如何建立？

植物细胞悬浮培养是指将植物细胞或较小的细胞团悬浮在液体培养基中，在培养过程中能保持良好的分散性。植物离体培养可以产生愈伤组织。松散的愈伤组织悬浮在液体培养基中，在振荡条件下培养一段时间后，可以形成分散的悬浮培养物。一个好的县浮培养应具备以下特征:(1)主要由单细胞和小细胞团组成；(2)细胞具有丰富的生长分裂能力，增殖速度快；(3)大多数细胞在形态上应具有分生组织细胞的特征。多数等径，核质比大，细胞质致密，非整倍体程度低。

在液体悬浮培养的过程中，要及时注意细胞的继代培养，因为当培养物生长到一定时期，就会进入分裂的静止阶段。对于大多数悬浮培养，细胞在18 ~ 25天时达到最大密度，此时应进行第一次继代培养。在传代培养中，应去除较大的细胞团块和接种物残留物。如果从植物器官或组织建立细胞悬浮培养系统，它包括愈伤组织诱导、继代培养、单细胞分离和悬浮培养。目前，该技术已广泛应用于细胞形态、生理、遗传和凋亡的研究，特别是为基因工程在植物细胞水平上的操作提供了理想的材料和途径。将转化的植物细胞诱导分化形成植株，并获得携带目的基因的个体。

主要试剂:

B5培养基加0.2mg NAA(萘乙酸)液体培养基(取3.2g B5粉末培养基，30g蔗糖，200ul体积质量为65438±0mg/ml的NAA原液，溶于约800ml蒸馏水中，置于磁力搅拌器中，混匀，用pH计测pH值。用1mol/l KOH调节pH值至5.8，加蒸馏水定容至1L，用铝箔纸封口，121℃灭菌20min，4℃冰箱保存，接种前水浴或自然升至室温)。

主要设备:

1.净化台

2.加压釜

3.旋转振动器

4.水浴锅

5.倒置显微镜

6.镊子

酒精灯

8.三角瓶

9.移液管

10.pH计

11.恒温培养室

12.烟囱

13.不锈钢屏

14.血细胞计数板等。

实验材料:

拟南芥愈伤组织

实验步骤:

1.用镊子取出旺盛柔软的胼胝，放入三角瓶中，轻轻捏碎。每100ml三角瓶中装有10~15ml灭菌培养基，每瓶接种1~1.5g愈伤组织，保证初始培养有足够的细胞。

2.将接种过的三角形放在旋转摇动器上。在65438±000转/分、25～28℃的条件下进行摇瓶培养。

3.培养6~10天后，若细胞增殖明显，可在培养瓶中加入10ml新鲜培养基，必要时用大口吸管将培养物分两瓶继续培养。(如果细胞没有明显增殖，可能是起始材料不合适，应考虑在旺盛增殖期重新接种愈伤组织)。可以进行第一次继代培养。

4.悬浮培养的过滤:按“3”法传代培养几代后，培养液应主要由单细胞和小细胞团组成(不超过20个细胞)。如果还含有有效的大细胞团，可以用适当孔径的金属网筛过滤，然后将过滤后的县内漂浮细胞继续培养。

5.细胞计算。取一定体积的细胞液，加入两倍体积的8%三氧化铬(CrO3)，置于70℃水浴中65438±05min。冷却后，用移液管反复吹细胞悬液，使细胞充分分散。混合后，取一滴县液，放在血细胞计数板上计数。

6.制作细胞生长曲线:为了了解县城漂浮培养细胞的生长动态，可采用以下方法绘制生长曲线:

1)鲜重法在传代培养的不同时间，取一定体积的悬浮培养物，离心收集后，称重细胞鲜重，以鲜重为纵坐标，培养时间为横坐标，绘制鲜重的生长曲线。

2)干重法可以在称重鲜重后将细胞干燥，然后称重干重。以干重为纵坐标，培养时间为横坐标，绘制细胞干细胞再生曲线。

以上两种方法需要每两天取样一次，* * *七次，每个样品重复三次。在整个实验过程中，没有新鲜的培养液被换入培养瓶中。

7.细胞活力的检查。对于初学者来说，经常需要检测活细胞的比例。在培养的不同阶段，可以吸取一滴细胞液放在载玻片上，滴一滴0。用1%苯酚藏红花溶液(用培养基制备)染色，并在显微镜下观察。有几个活细胞是不着色的，而死细胞很快就被染成红色。也可以用0。用1%荧光二乙酸盐溶液染色，所有活细胞在紫外光的诱导下都会呈现蓝色荧光，有经验的操作者可以根据细胞形态和胞质循环来判断细胞的生死。

8.细胞再生能力的鉴定:为了知道悬浮培养的细胞是否还有再生能力，可以将培养的细胞转移到琼脂固化的培养基上，使基部再次形成愈伤组织，然后在分化培养基上诱导植株的分化。

注意事项:

1.以上步骤均为灭菌，培养基、器皿、用具均高压灭菌后方可使用。

2.如果培养基浑浊或呈乳白色，说明已经被污染。

3.在每次传代培养过程中，要在倒置显微镜下观察培养物中的各种细胞和其他残留物，有意识地留下圆形细胞，丢弃长细胞。